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抗體常見(jiàn)問(wèn)題及解答

Q: 什么是特定的抗體?

抗體(Ab),也被稱(chēng)為免疫球蛋白(Ig),是一種Y型的蛋白質(zhì),通過(guò)Fab區域的可變區域來(lái)中和病原體,例如致病性細菌和病毒。

Q: 如何選擇適合我的實(shí)驗的正確抗體?CUSABIO是否提供具有多種應用的抗體?

您在選擇抗體時(shí)需要注意以下幾個(gè)方面:樣本的物種、抗體的宿主物種、抗體的標記方式以及適用于您實(shí)驗的推薦稀釋比例。CUSABIO保證其抗體適用于標注在網(wǎng)站或產(chǎn)品數據表上的應用和物種。如果您使用的應用我們沒(méi)有測試過(guò),我們將為您提供試用樣品,在購買(mǎi)正裝之前進(jìn)行評估。

Q: 單克隆抗體和多克隆抗體有什么區別?

單克隆抗體是使用相同的克隆免疫細胞制備而成,它們都是來(lái)自一個(gè)特定的母細胞的克隆。因此,它們對同一抗原和表位具有親和力。多克隆抗體是使用多個(gè)不同的免疫細胞制備而成,它們對同一抗原具有親和力,但結合的表位不同。單克隆抗體只結合一個(gè)表位,而多克隆抗體則結合同一蛋白質(zhì)上的不同表位。單克隆抗體比多克隆抗體更加特異且背景噪音更少,因此在生化分析中通常更可取。然而,單克隆抗體的生產(chǎn)成本通常更高,適應性較差,并且對抗原的微小變化非常敏感。

Q: 一抗和二抗之間有什么關(guān)系?如何選擇適合我實(shí)驗的正確二抗?

一般情況下,一抗用于捕獲目標蛋白,二抗能夠與一抗結合,并且標記有可以放大檢測信號的酶或染料。我們建議您考慮以下幾個(gè)因素:

a. 根據宿主物種選擇。例如,如果一抗來(lái)自小鼠,那么二抗應該是抗小鼠的。

b. 根據一抗的特性選擇。

c. 根據您的實(shí)驗應用,例如WB、IHC、ELISA等。

Q: 您能告訴我每個(gè)抗體結合多少個(gè)生物素嗎?

生物素與抗體的摩爾比為36.6:1。然而,很難準確說(shuō)出每個(gè)抗體結合了多少個(gè)生物素,因為標記是通過(guò)賴(lài)氨酸殘基進(jìn)行的,并不清楚有多少個(gè)原始氨基團與生物素結合。平均而言,每個(gè)IgG分子可以結合3—5個(gè)生物素分子。

Q: 為什么實(shí)際帶狀物的分子量大于理論分子量?

您可以使用CUSABIO的分子量計算器計算抗體的分子量。如果測試結果與理論分子量之間有很大差異,可能的原因包括:目標蛋白存在多個(gè)修飾位點(diǎn),例如糖基化,或者與其他蛋白質(zhì)形成穩定的復合物,或者被切割或降解。

Q:為什么我收到的抗體容量少于標簽上所標示的容量?

在運輸和儲存過(guò)程中,少量的抗體可能會(huì )附著(zhù)在產(chǎn)品瓶蓋的密封處。如果需要,可以在臺式離心機上對瓶子進(jìn)行短暫離心,以使容器蓋中的液體脫離。

Q: 您能為該抗體推薦同型對照嗎?

同型對照用于確認一抗結合的特異性,以排除非特異性Fc受體結合或其他蛋白質(zhì)相互作用的影響。同型對照抗體應與一抗的宿主物種、同型和標記方式相匹配。例如,如果一抗是FITC標記的小鼠IgG1,那么您需要選擇一款FITC標記的小鼠IgG1同型對照。大多數同型對照抗體是單克隆抗體,多克隆抗體不適用,因為多克隆抗體含有多個(gè)IgG亞類(lèi)。

Q: 用哪種緩沖液來(lái)儲存抗體?

我們使用0.01M PBS緩沖液(pH 7.4)加入50%甘油。

Q: 您可以提供哪種類(lèi)型的抗體標記?

我們目前提供FITC、HRP、生物素等隨機標記在游離的賴(lài)氨酸(Lys)氨基上的標記。

Q: 為什么有些抗體不再提供?

我們從庫存中剔除這些抗體,是因為我們有新的產(chǎn)品替代它們。

Q: 為什么在免疫印跡(Western Blot)中沒(méi)有帶狀物?

可能存在的原因有:

a. 抗體不足。一些抗體可能與目標蛋白的親和性較差。您應該減少抗體的稀釋倍數(比推薦的起始稀釋度低2-4倍)。同時(shí),抗體可能已失去活性,您應該進(jìn)行點(diǎn)印跡(Dot Blot)實(shí)驗。

b. 蛋白質(zhì)不足。您應該提高在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。通過(guò)其他方法確認蛋白質(zhì)的存在。使用陽(yáng)性對照(重組蛋白、細胞系或處理細胞以表達感興趣的分析物)。進(jìn)行點(diǎn)印跡實(shí)驗。

c. 轉膜不良。您應該用甲醇濕潤PVDF/Immobilon-P膜,或者用轉膜緩沖液濕潤硝酸纖維膜,以確保PVDF膜與凝膠之間有良好接觸。

d. 轉膜不完全。您應該延長(cháng)轉膜時(shí)間,因為一些分子量較大的蛋白質(zhì)可能需要更長(cháng)的轉膜時(shí)間。

e. 過(guò)度轉膜。對于分子量較?。ǖ陀?0 kDa)的蛋白質(zhì),您應該減少轉膜電壓或時(shí)間。

f. 等電點(diǎn)大于9。您應該使用更高pH值的替代緩沖體系,如CAPS(pH 10.5)。

g. 使用了錯誤的二抗。您應該確認一抗的宿主物種和抗體類(lèi)型,以選擇正確的二抗。

h. 抗體無(wú)效。不要使用過(guò)期的抗體。

i. 存在偶氮二碘苯酚(Sodium azide)污染。確保緩沖液不含偶氮二碘苯酚,因為它可能熄滅HRP信號。

j. 一抗的孵育時(shí)間不足。您應該延長(cháng)一抗的孵育時(shí)間,最好過(guò)夜孵育在4℃。

Q: 在免疫印跡(Western Blot)中為什么信號弱?

可能存在的原因有:

a. 蛋白質(zhì)與抗體結合較弱。您應該盡量減少洗滌次數。減少抗體溶液中的NaCl濃度,或者在洗滌步驟中使用印跡緩沖液(推薦范圍為0.15 M-0.5 M)。

b. 抗體不足。您應該將抗體濃度增加到比推薦的起始濃度高2-4倍。

c. 蛋白質(zhì)不足。您應該提高在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。

d. 反應偶聯(lián)不活性。您應該在管中混合酶和底物。如果顏色不顯現或者顏色較弱,可以制備新的試劑或購買(mǎi)新的試劑。嘗試使用ECL。

e. ECL試劑過(guò)弱/過(guò)舊。您應該購買(mǎi)新的ECL試劑。

f. 脫脂奶可能掩蓋了某些抗原。您應該減少阻斷液中脫脂奶的百分比,或者用3%牛血清白蛋白(BSA)代替。

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Q: 為什么在免疫印跡(Western Blot)中出現額外的帶狀物?

可能存在的原因有:

a. 主抗體的非特異性結合。您應該增加主抗體的稀釋倍數。減少在凝膠上加載的總蛋白質(zhì)量。使用單克隆抗體或抗原親和純化的抗體。

b. 二抗的非特異性結合。您應該進(jìn)行一個(gè)只用二抗的對照試驗(不加主抗體)。如果出現條帶,則選擇其他二抗,使用單克隆抗體或抗原親和純化的抗體。

c. 分析物的降解。您應該盡量減少樣品的凍融循環(huán),存儲前向樣品中添加蛋白酶抑制劑,或制備新鮮樣品。

d. 分析物的聚集。您應該增加DTT的用量以確保還原二硫鍵(20-100 mM DTT)。在加載凝膠前,將樣品置于沸水中煮沸5—10分鐘。進(jìn)行短時(shí)間的離心。

e. 試劑的污染。您應該檢查緩沖液是否被污染,或者嘗試制備新鮮的試劑。

Q: 在免疫印跡(Western Blot)中為什么會(huì )出現條狀模糊?

可能存在的原因有:

a. 主抗體的非特異性結合。您應該將單克隆抗體或抗原親和純化的抗體以更低的濃度稀釋在5%牛奶中,或者調整非脫脂奶粉(2%-5%)或NaCl(0.15-0.5 M)濃度作為主抗體溶液。

b. 二抗的非特異性結合。您應該進(jìn)行一個(gè)只用二抗的對照實(shí)驗(不加主抗體)。如果在膜上出現了條帶,則應該稀釋該抗體或嘗試其他二抗。

c. 阻斷不足。您應該使用含有0.1%—0.5% Tween 20、0.15-0.5 M NaCl和25 mM Tris (pH 7.4)的5%脫脂奶粉溶液進(jìn)行阻斷??梢匝娱L(cháng)阻斷時(shí)間。根據需要調整奶粉濃度。在4℃下過(guò)夜阻斷可能會(huì )降低阻斷效果,因為低溫下洗滌劑可能不起作用。

d. 洗滌不足。您應該增加洗滌緩沖液中Tween 20的濃度(0.1%—0.5%),或增加洗滌次數。

e. 脫脂奶粉中可能含有目標抗原或內源性生物素,并且與親和素/鏈霉親和素不相容。您應該使用3% BSA進(jìn)行替代。

f. 某些IgY抗體可能會(huì )識別奶蛋白。您應該使用3% BSA進(jìn)行替代。

g. 膠片曝光過(guò)度。您應該減少曝光時(shí)間。如果目標信號過(guò)強,請多等待5—10分鐘后重新曝光膠片。

Q: 在免疫印跡(Western Blot)中,為什么條帶看起來(lái)模糊且不規則?

可能存在的原因有:

a. 凝膠不好。在填充之前應徹底攪拌溶液。

b. 某些樣品的鹽濃度較高。您應該對樣品進(jìn)行脫鹽或調整鹽濃度。

c. 每個(gè)孔中的樣品體積不一致。您應該調整樣品體積,使其基本相同。

d. 緩沖液不起作用。您應該購買(mǎi)新的緩沖液或制備新的緩沖液。

e. 膜中有氣泡困住。在轉膜過(guò)程中要小心地去除任何氣泡。

f. 電泳過(guò)程中溫度過(guò)高。您應該減小電流或電壓。

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Q: 在免疫印跡(Western Blot)中,為什么轉膜效率低?

可能存在的原因有:

a. pH值接近等電點(diǎn)。您應該增加轉膜緩沖液的pH值。

b. 膜中有氣泡困住。在轉膜過(guò)程中要小心地去除任何氣泡。

c. 濾紙接觸。濾紙、轉膜和凝膠的大小應基本相同,以避免濾紙直接接觸。

d. 轉膜選擇不當。您應該使用可靠的PVDF膜或硝酸纖維膜。

e. 電壓或電流過(guò)低。我們建議在濕轉膜過(guò)程中使用20 mA的恒定電流,半干轉膜時(shí)使用25 V的恒定電壓。

f. 轉膜時(shí)間過(guò)長(cháng)或過(guò)短。根據蛋白質(zhì)的大小和使用的電泳設備,選擇適當的轉膜時(shí)間。

g. 濕轉膜過(guò)程中環(huán)境溫度過(guò)高。您應該使用預冷的轉膜緩沖液或將裝置設置為4℃。

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Q: 在免疫組織化學(xué)染色中,為什么染色缺失?

可能存在的原因有:

a. 缺乏抗原。我們建議通過(guò)原位雜交檢測蛋白質(zhì)的表達,因為在某些罕見(jiàn)情況下,即使已檢測到mRNA,蛋白質(zhì)的翻譯可能被阻斷。

b. 抗原在與一抗孵育之前被破壞。如果在添加一抗之前進(jìn)行了內源性過(guò)氧化物酶的消除,您應該在與一抗孵育后對過(guò)氧化物酶進(jìn)行阻斷。

c. 抗原恢復效果不好。您應該增加處理時(shí)間或更換處理溶液。

d. 抗體因存儲不當而失效。您應該按照手冊上的存儲說(shuō)明操作。通常將抗體分裝成足夠制備單次實(shí)驗的小體積,避免反復凍融。

e. 一抗或二抗失活。您應該獨立測試報告系統以評估試劑的有效性。

f. 一抗和二抗不兼容。您應該使用能與一抗相互作用的二抗。例如,如果一抗是兔源的,則使用抗兔二抗。

g. 組織固定不充分。您可以嘗試增加固定時(shí)間或嘗試不同的固定劑。

h. 組織過(guò)度固定。您應該減少浸泡或后固定步驟的時(shí)間。如果無(wú)法避免浸泡固定,可以通過(guò)使用抗原恢復試劑來(lái)使抗原重新顯露。

i. 抗原在固定或包埋過(guò)程中發(fā)生變化。您可以嘗試通過(guò)各種抗原恢復技術(shù)來(lái)恢復免疫反應性。

j. 遺漏或錯誤使用試劑。您應該重復染色,并確認正確使用了正確順序的試劑。

Q: 在免疫組織化學(xué)染色中,為什么染色結果不合適?

可能存在的原因有:

a. 固定方法對抗原不適用。您可以嘗試不同的固定劑或增加固定時(shí)間。

b. 抗原恢復方法對該抗原或組織不適用。您可以嘗試不同的抗原恢復條件。

c. 抗原的靜電荷發(fā)生了變化。您可以嘗試調整抗體稀釋液的pH值或陽(yáng)離子濃度。

d. 固定延遲導致抗原擴散。您應該及時(shí)固定組織,并嘗試使用交聯(lián)固定劑而不是有機(醇)固定劑。

Q: 在免疫組織化學(xué)染色中,為什么背景較高?

可能存在的原因有:

a. 一抗和/或二抗濃度過(guò)高。您應該進(jìn)行滴定實(shí)驗,確定促進(jìn)一抗和二抗特異反應所需的最佳濃度。

b. 一抗或二抗與組織的非特異性結合。您應該在一抗孵育之前進(jìn)行阻斷步驟。非脂乳粉是另一個(gè)選擇。

c. 二抗的非特異性結合。您應該使用去除了交叉反應IgG物種的抗體(對樣本物種進(jìn)行吸附)。

d. 抗體與組織中的蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用。您應該降低抗體稀釋液的離子強度。

e. 背景由離子相互作用引起。您應該增加稀釋緩沖液的離子強度。

f. 組織變干。在染色過(guò)程中避免組織變干。

g. 試劑附著(zhù)在老舊或準備不良的玻片上。您應該重新準備新鮮的或購買(mǎi)的玻片。

Q: 在免疫組織化學(xué)染色中,為什么組織或細胞形態(tài)會(huì )被破壞?

可能存在的原因有:

a. 抗原恢復方法過(guò)于嚴酷。您應該根據經(jīng)驗確定能夠保持組織形態(tài)的條件,同時(shí)恢復抗原的免疫活性。

b. 組織切片脫落玻片。您應該增加固定時(shí)間。根據經(jīng)驗確定額外或替代性的固定劑。使用新鮮制備的、電荷充足的玻片。

c. 染色過(guò)程中未完全固定導致物理?yè)p傷組織或細胞。您應該增加固定時(shí)間和/或增加后固定步驟。增加固定劑/組織比例。切割更小的組織塊以進(jìn)行更徹底地浸潤固定。

d. 組織自溶導致壞死碎片染色。您應該增加固定時(shí)間和比例??紤]使用交聯(lián)固定劑。

e. 組織切片出現撕裂或折疊。您應該在切片下除去氣泡。使用鋒利的刀片重新切割切片,或在分析結果時(shí)忽略損壞區域。

f. 組織形態(tài)分辨率差。對于冰凍切片,應該切割更薄的組織切片,因為冰晶可能破壞了組織形態(tài)。

Q: 在免疫沉淀(IP)中,為什么會(huì )有太多的抗體洗脫?

您應該在進(jìn)行免疫沉淀前將抗體與珠子混合,并使用溫和的甘氨酸緩沖液梯度洗脫,這樣可以顯著(zhù)減少抗體的數量。

Q: 為什么免疫沉淀(IP)中的背景太高?

可能存在的原因有:

a. 抗體與非特異性結合過(guò)多。您應該使用純化的抗體,并減少使用的量。

b. 細胞過(guò)多/蛋白質(zhì)過(guò)多導致洗脫物中存在大量非特異性蛋白質(zhì)。減少使用的細胞數量/裂解液(10-500 µg)。

c. 不能溶解的蛋白質(zhì)殘留。在離心后立即去除上清液。這樣應該將不溶性蛋白質(zhì)留在沉淀中。如果重新懸浮發(fā)生,再次離心。

d. 準備的珠子過(guò)少。您應該確保BSA新鮮,并使用足夠的珠子在PBS中含有1%的BSA中孵育1小時(shí)。在使用之前用PBS洗滌3—4次。

e. 洗滌不徹底。您應該在相關(guān)階段進(jìn)行充分的洗滌,將蓋子蓋在離心管上,并在離心之前多次倒置。

f. 在免疫沉淀過(guò)程中,抗原降解。您應該在裂解之前添加新鮮的蛋白酶抑制劑。

Q: 在染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)中,為什么大區域顯示低分辨率且背景噪音高?

您應該優(yōu)化DNA片段(不超過(guò)1.5 kb)。

Q: 為什么在染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)中樣本中無(wú)法擴增DNA?

您應該選擇陽(yáng)性對照模板DNA來(lái)確認引物的工作情況。

Q: 在流式細胞術(shù)(FC)中為什么會(huì )有高背景?

可能存在的原因有:

a. 增益設置過(guò)高。您應該降低增益以減少信號,并使用陽(yáng)性對照來(lái)正確設置流式細胞儀。

b. 抗體過(guò)多。您應該減少抗體濃度。

Q: 為什么在流式細胞術(shù)(FC)中觀(guān)察到兩個(gè)或更多的細胞群體?

可能存在的原因有:

a. 存在多個(gè)細胞群體表達目標蛋白。您應該檢查細胞分離是否充分。

b. 存在細胞二聚體。細胞二聚體將顯示為圖上大約兩倍熒光強度的第二個(gè)細胞群體。您應該在染色之前和在流式細胞儀上運行之前使用移液管輕輕混合細胞。

Q: 我應該如何儲存和分裝抗體?

抗體在室溫下只穩定幾天。請在收到后將抗體分裝并儲存在-20℃。請避免反復凍結和解凍,您可以根據實(shí)驗中使用的量來(lái)分裝抗體,但每個(gè)分裝物的量不應少于10 μL。每個(gè)分裝物的量越小,液體蒸發(fā)和容器吸附對抗體濃度的影響就越大。

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