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制備抗體時(shí)抗原的選擇

一天之計在于晨,一年之計在于春。那么制備一個(gè)抗體,抗原的設計和表達系統的選擇則至關(guān)重要,可以毫不夸張的說(shuō),設計出一個(gè)好的抗原對于制備一個(gè)高質(zhì)量抗體來(lái)說(shuō)就是成功了一大半。

設計抗原時(shí),對抗原的結構分析、B細胞表位預測尤其重要。


1. 抗原的結構分析

不同的蛋白類(lèi)型,選擇的方法需要多樣性。大部分情況下,蛋白C端的親水性、表面可及性和柔性都相對N端較好。蛋白的二級結構也是預測B細胞表位重要參數之一,β轉角為凸出結構,多出現在蛋白質(zhì)抗原表面,有利于與抗體結合,較可能成為抗原表位。而α螺旋和β折疊結構規則不易變形,較難結合抗體,一般不作為抗原表位。含有5個(gè)以上的氨基酸殘基的轉角又常稱(chēng)為環(huán)(loop)。以往的研究表明,蛋白表面的loop區可能為功能性抗體的識別位點(diǎn),特異性好,可及性強。

Uniprot數據庫和CBS服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/)預測信號肽、跨膜、表位等結構;EX-PASY服務(wù)器(http://www.expasy.org/tools)上的GOR4、HNN、SOPMA、nnPredict等方法。親水性、柔韌性、表面可能性、抗原表位預測、α螺旋和β折疊可以應用DNAstar軟件預測,同時(shí)可以結合Uniprot數據中的蛋白結構分析。MOE軟件也可以預測蛋白的結構,同時(shí)MOE軟件可以從多個(gè)角度分析蛋白的結構特性。

例如蛋白A:

1.1 信號肽分析時(shí),表明該序列無(wú)信號肽


1.2 跨膜域分析,顯示該序列全部在胞外域


1.3 亞細胞定位預測


1.4 全長(cháng)蛋白各功能域劃分


1.5 蛋白二級結構,親水性,抗原性,表面可極性,柔性分析


2. B細胞表位預測的方法及應用

線(xiàn)性表位的預測方法: B細胞表位的預測方法主要集中于線(xiàn)性表位,大量的預測B細胞表位的算法都是基于蛋白質(zhì)序列。這些算法包括:蛋白質(zhì)的親水性算法、可及性算法、蛋白質(zhì)可塑性算法、蛋白質(zhì)二級結構預測算法、蛋白質(zhì)抗原性算法。這些方法的代表軟件有PEOPLE、PREDITOP、BEPITOPE、Bcepred、ABCpred、BepiPred、APP等。

構象表位的預測方法:絕大多數B細胞表位預測方法都是基于蛋白質(zhì)的一級或二級結構的,但這些方法只能用來(lái)預測由連續的氨基酸殘基構成的線(xiàn)性表位,而基于蛋白質(zhì)的三級結構來(lái)預測構象表位的方法比較少,這是因為各種抗原的構象表位可獲得的數據要遠遠少于線(xiàn)性表位。

基于蛋白質(zhì)三級結構來(lái)預測構象表位的方法CEP:這是第一個(gè)以抗原蛋白的三級結構PDB文件作為輸入條件,以構象性表位預測為主要目的的網(wǎng)上免費服務(wù)軟件。由于抗原抗體之間的相互作用屬于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用中的一種,因此,可以參這些方法來(lái)預測B細胞表位。

分子對接:主要用來(lái)研究分子間的相互作用與識別,進(jìn)而預測復合物結構。常用的分子對接軟件有ZDOCK、DOT、DOCK、ClusPro等。


3. 抗原的表達系統的選擇

通過(guò)對抗原的結構和B細胞表位分析預測后,然后再結合抗體的使用要求,進(jìn)行選擇適當的區間以及表達系統進(jìn)行抗原表達純化。

針對于簡(jiǎn)單的應用WB\IHC\IF\IP這類(lèi)的檢測應用型的抗體,我們推薦的是蛋白的成熟的非跨膜區間,表達系統可以選擇大腸、酵母這種成功率高、經(jīng)濟成本相對于較低的蛋白表達系統,抗體的類(lèi)型可以選擇多抗和單抗。同時(shí),這類(lèi)型的抗體還可以選擇直接合成多肽偶聯(lián)載體后作為抗原,進(jìn)行免疫動(dòng)物。

如果是正對與IF、FC、細胞、抗體結合等實(shí)驗的話(huà),我們推薦的蛋白是全長(cháng)的或者成熟的跨膜和非跨膜區間,表達系統主要選擇無(wú)細胞、哺乳、酵母這類(lèi)具有蛋白活性或者能表達出全長(cháng)的表達系統進(jìn)行表達蛋白,對應的抗體類(lèi)型主要選擇單抗和基因工程抗體。


各種分析網(wǎng)站:

https://psort.hgc.jp/form2.html 亞細胞定位分析

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/ 信號肽分析

http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv_submit.html 跨膜分析

https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html 線(xiàn)粒體轉運肽分析

http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi 核定位分析

http://www.proteinatlas.org/ 表達預測(人種屬)

https://bgee.org/?page=gene 表達豐度預測

http://old.protein.bio.unipd.it/espritz/ 結構無(wú)序性分析

https://swissmodel.expasy.org/ 三級結構預測

http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 糖基化修飾預測分析

https://www.ebi.ac.uk/interpro/ 功能預測分析