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無(wú)細胞蛋白表達與純化服務(wù)

無(wú)細胞蛋白表達系統又稱(chēng)為體外翻譯系統。無(wú)細胞蛋白質(zhì)合成體系是以外源目的mRNA或DNA為模板,在細胞抽提物的酶系中通過(guò)人工添加蛋白質(zhì)合成所需的底物和能量,合成目的蛋白質(zhì)的體外蛋白合成系統。無(wú)細胞蛋白表達系統模擬生物細胞的生命現象,重現胞內蛋白轉錄翻譯過(guò)程,它需要包含蛋白質(zhì)合成過(guò)程中所必需的各種原料、能量、轉錄因子和翻譯因子等。

該系統尤其適于膜蛋白和毒性蛋白的表達,同時(shí)具有周期短、通量高的特點(diǎn)。

該系統已有10多年歷史,但是技術(shù)難度較大。目前全球范圍內,無(wú)細胞表達主要以Rothe、Promega等公司提供的試劑盒表達方案為主,條件單一,價(jià)格昂貴。華美生物是國內第一批掌握大腸桿菌無(wú)細胞表達體系全套核心技術(shù)的公司,所有試劑均自配,核心組分均自產(chǎn),反應體系含40余種成分,均可自由調整優(yōu)化。自2015年建立該平臺以來(lái),已成功制備400多種蛋白,其中包含300多種傳統大腸桿菌表達系統難以表達的1-15次跨膜蛋白和毒性蛋白,其中含有分子量高達130kDa-140kDa的多次跨膜蛋白。

系統優(yōu)勢

  • 不受細胞結構限制,可以表達對宿主細胞有毒的外源蛋白質(zhì);
  • 高通量,可以在多孔板上在各種不同條件下同時(shí)表達幾種不同的蛋白,適用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究;
  • 開(kāi)放式反應系統使反應條件易于更改,有助于調節基因轉錄、蛋白質(zhì)合成和后翻譯修飾;
  • 允許添加非天然氨基酸或同位素標記的氨基酸來(lái)合成特殊用途的蛋白質(zhì);
  • 步驟少,實(shí)驗過(guò)程簡(jiǎn)單,對設備依賴(lài)性較低。

服務(wù)優(yōu)勢

  • 超高性?xún)r(jià)比,低至5500元起;
  • 貨期短,20-25個(gè)工作日內即可交付;
  • 產(chǎn)量高,部分蛋白可以達到5mg/mL。

我們承諾

無(wú)風(fēng)險定制,不成功不收費

注:該無(wú)風(fēng)險定制蛋白服務(wù)僅適用于800個(gè)氨基酸以?xún)鹊牡鞍踪|(zhì)。如果您需要表達超過(guò)800個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),我們將按步驟收費。

特色技術(shù)平臺

去垢劑技術(shù)平臺

去污劑是同時(shí)具有親水極性基團和疏水非極性基團的雙極性分子,能夠使脂膜解體釋放膜蛋白,并在溶液中為去膜狀態(tài)下的膜蛋白提供疏水環(huán)境,維持膜蛋白的疏水跨膜結構。

華美生物搭建了基于無(wú)細胞表達的去垢劑技術(shù)平臺。通過(guò)體外添加DNA模板、ATP、氨基酸、各種底物、細胞抽提物的酶等合成蛋白質(zhì),篩選不同去垢劑來(lái)提取目的蛋白,可很好溶解純化跨膜蛋白,幫助其在溶液中形成天然正確構象。

Nanodisc技術(shù)平臺

在含有去垢劑的緩沖液中,大部分膜蛋白可以維持穩定性和活性。但少數對去垢劑敏感的膜蛋白是不適宜含有去垢劑的緩沖條件的,具體表現為無(wú)法純化,穩定性不好和沒(méi)有活性。

華美生物搭建了基于無(wú)細胞表達的Nanodisc技術(shù)平臺。通過(guò)體外添加MSP,磷脂分子使其在反應過(guò)程中邊表達邊組裝成Nanodisc結構,保持其生物學(xué)活性并有很好的水溶性。

服務(wù)內容

步驟 服務(wù)項目 服務(wù)說(shuō)明 華美生物特色 周期
1 質(zhì)粒構建及制備
密碼子優(yōu)化、全基因合成 多載體優(yōu)化
為了得到最高的表達量并且最低的序列修飾,除常規N端融合表達蛋白外,我們還提供N端短肽優(yōu)化表達服務(wù)。N端短肽包含6-11個(gè)氨基酸,可提高mRNA翻譯效率,從而提高蛋白產(chǎn)量。
5-10工作日
PCR擴增產(chǎn)物通過(guò)酶切連接到pET系列載體上
重組質(zhì)粒大量制備
2 小試表達及優(yōu)化
多載體多反應條件優(yōu)化,SDS-PAGE電泳檢測,以確定最優(yōu)反應條件 多條件表達方案
無(wú)細胞表達能在多孔板上按照多種不同的條件,多種不同的蛋白同時(shí)平行進(jìn)行。我們提供多條件優(yōu)化表達服務(wù)。
7-10工作日
(多條件純化方案周期另加
3-5個(gè)工作日)
3 目標蛋白表達及純化
根據小量結果提供1-10ml放大體系表達
通過(guò)親和、離子交換及分子篩等多種層析方法純化目的蛋白 多條件純化方案(可選)
針對膜蛋白,我們提供不同去垢劑純化服務(wù),以確保您的膜蛋白適合的最佳緩沖?;钚阅さ鞍鬃钸m合采用該優(yōu)化方案。
4 其他(可選)服務(wù)
收費 酶切去標簽服務(wù) 靈活的附加服務(wù)(可選)
提供多種附加服務(wù),客戶(hù)可根據實(shí)驗需求靈活選擇
3個(gè)工作日
免費 可提供無(wú)菌操作、內毒素去除和凍干等服務(wù)(備注:凍干與無(wú)菌操作不可同時(shí)滿(mǎn)足) 2個(gè)工作日
5 質(zhì)控
進(jìn)行純度、濃度等檢查,并提供QC報告 詳細的質(zhì)控報告
為每個(gè)項目提供產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)及完善的質(zhì)控報告
3-5工作日
總時(shí)間 20-30工作日

案例展示

案例1:無(wú)細胞表達系統表達多次跨膜蛋白

以下三個(gè)蛋白質(zhì)分別具有5、6和7個(gè)跨膜結構域。由于在體內表達系統中難以表達多次跨膜蛋白質(zhì),或者產(chǎn)量非常低,華美生物使用無(wú)細胞表達系統來(lái)制備這三個(gè)蛋白質(zhì)。為了增加產(chǎn)量,我們嘗試了各種表達條件供客戶(hù)選擇。圖1、2和3分別展示了這三個(gè)蛋白質(zhì)在不同條件下的小規模表達情況,并選擇最佳條件進(jìn)行大規模表達。

Lane1:反應條件1
Lane2: 反應條件2
Lane3: 反應條件3
Lane4: 反應條件4
Lane5: 反應條件5
Lane6: 反應條件6

Lane1:反應條件1
Lane2: 反應條件2
Lane3: 反應條件3
Lane4: 反應條件4
Lane5: 反應條件5
Lane6: 反應條件6

Lane1:反應條件1
Lane2: 反應條件2
Lane3: 反應條件3
Lane4: 反應條件4
Lane5: 反應條件5
Lane6: 反應條件6


案例2:無(wú)細胞表達系統表達大分子量高次跨膜蛋白

所展示案例為9次跨膜蛋白,分子量為141.7kDa?;诩毎谋磉_系統難以表達高次且大分子量跨膜蛋白。華美生物采用大腸無(wú)細胞表達系統成功表達,SDS-PAGE檢測肉眼可見(jiàn)。

Lane1:反應條件1
Lane2: 反應條件2
Lane3: 反應條件3
Lane4: 反應條件4
Lane5: 反應條件5

案例3:無(wú)細胞表達系統顯著(zhù)提高蛋白表達量

這個(gè)項目的蛋白質(zhì)產(chǎn)量很低,華美生物采用無(wú)細胞表達系統,通過(guò)優(yōu)化不同的N-末端肽,產(chǎn)量顯著(zhù)提高,如圖5所示。

Lane 1: 標簽 1
Lane 2: pET-28a(+) control
Lane 3: 標簽2
Lane 4: 標簽3
Lane 5: 標簽4
Lane 6: 標簽5
Lane 7: 標簽6
Lane 8: 標簽7

案例4:無(wú)細胞表達系統表達高活性膜蛋白

HTR1B為GPCR系列的膜蛋白,含有7次跨膜域。我們成功表達了該蛋白質(zhì)并進(jìn)行了功能活性驗證,結果表明該蛋白質(zhì)具有生物活性。

The Binding Activity of HTR1B (7TM) with GSTK1

Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized HTR1B at 5 μg/ml can bind human GSTK1, the EC50 of human GSTK1 protein is 159.40-218.50 ng/ml.

SLC7A11含有12次跨膜域。我們成功表達了該蛋白質(zhì)并進(jìn)行了功能活性驗證,結果表明該蛋白質(zhì)具有生物活性。

The?Binding?Activity?of?SLC7A11?with?anti-SLC7A11?recombinant?antibody

Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized human SLC7A11 at 2 μg/ml can bind anti-SLC7A11 recombinant antibody, the EC50 is 12.70-16.68ng/ml


案例5:無(wú)細胞表達系統使用不同去垢劑純化膜蛋白

圖1:FOS-12去垢劑純化7次跨膜蛋白

泳道1:蛋白1原樣
泳道2:穿透
泳道3-4:洗脫
泳道5:蛋白2原樣
泳道6:穿透
泳道7-8:洗脫

圖2:Brij-78去垢劑純化11次跨膜蛋白

泳道1-5:洗脫
泳道6:穿透
泳道7:原樣

聯(lián)系信息

    電話(huà):027-87002556

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武漢華美生物工程有限公司成立于2007年12月,是一家集科研、生產(chǎn)、銷(xiāo)售為一體的生物高新技術(shù)企業(yè)。并形成了以CUSABIO為品牌的ELISA試劑盒、蛋白、抗體等多種優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品,遠銷(xiāo)歐美日德等九十多個(gè)國家。
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