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酵母表達純化服務(wù)

酵母蛋白表達系統是一種高經(jīng)濟性的真核表達系統,可分泌表達表達也可胞內表達。

酵母表達外源基因具有一定的翻譯后加工能力,所表達的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾,性質(zhì)較原核表達的蛋白質(zhì)更加穩定,特別適用于真核基因表達和功能蛋白的制備。

酵母分泌表達可以將表達的外源蛋白分泌到細胞外基質(zhì)中,因此更容易獲得高純度蛋白。

酵母表達系統具有的諸多優(yōu)勢使其研究和應用越來(lái)越廣泛。

系統優(yōu)勢

  • 無(wú)自產(chǎn)內毒素;
  • 產(chǎn)物可翻譯后修飾:糖基化、磷酸化、酰酯化等,蛋白具有生物活性的可能性更高;
  • 產(chǎn)物可正確折疊和高效分泌;
  • 性質(zhì)較原核表達的蛋白質(zhì)更加穩定,特別適合于表達和制備具有功能的蛋白:如結核類(lèi)蛋白、防御素類(lèi)蛋白、白介素蛋白及細胞因子等。

服務(wù)優(yōu)勢

  • 無(wú)風(fēng)險定制,不成功不收費;
  • 特有的PickRight技術(shù),轉化后免篩選直接可獲得高表達量菌株,相比傳統篩選節省5-10個(gè)工作日;
  • 高產(chǎn)量:搖瓶培養條件下高達100mg/L;
  • 高性?xún)r(jià)比:價(jià)格低至5200元起;
  • 貨期短:最短35工作日即可交付。

我們承諾

無(wú)風(fēng)險定制,不成功不收費

注:該無(wú)風(fēng)險定制蛋白服務(wù)僅適用于800個(gè)氨基酸以?xún)鹊牡鞍踪|(zhì)。如果您需要表達超過(guò)800個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),我們將按步驟收費。

服務(wù)內容

步驟 服務(wù)項目 服務(wù)說(shuō)明 華美生物特色 周期
1 表達載體構建
密碼子優(yōu)化全基因合成 多載體優(yōu)化
為了提高的表達成功率以及獲得更高表達量,除常規N端融合表達蛋白外,我們還提供C端融合標簽,在確保純度的同時(shí)使其具有活性可能更高。
5-10工作日
PCR擴增產(chǎn)物酶切連接到pPic9k,pPic3.5k,pPiczαA等載體上
轉化TOP10宿主
獲得測序正確的重組質(zhì)粒
2 轉化及菌株鑒定
重組質(zhì)粒大量制備 高拷貝篩選
通過(guò)不同載體特有的篩選標記進(jìn)行多輪篩選,逐步得到表達量最高的菌株。
銅離子脅迫專(zhuān)利
轉化后免篩選直接可獲得高表達量菌株,時(shí)間相比傳統篩選減少5-10工作日。
10-13工作日
線(xiàn)性化重組質(zhì)粒
電擊轉化至GS115、X33、KM71等宿主
PCR鑒定挑選陽(yáng)性菌株
用遺傳霉素G418、Zeocion等抗生素進(jìn)行多拷貝子篩選,獲得高拷貝子
3 小試及放大表達純化
小試表達篩選(20-40株) 7-12工作日/15-25工作日(特色純化)
定株,優(yōu)化表達條件
放大培養
通過(guò)親和、離子交換、疏水及分子篩等多種層析方法純化目的蛋白 多條件純化策略(可選)
完善的DOE方案,利用AKTA對離子交換、疏水等層析條件進(jìn)行摸索,鎖定最適純化策略。
4 其他(可選)
通過(guò)酶切去除標簽或采用無(wú)標簽載體表達 靈活的附加服務(wù)(可選)
提供多種附加服務(wù),客戶(hù)可根據實(shí)驗需求靈活選擇
3工作日
提供無(wú)菌過(guò)濾及內毒素去除服務(wù) 2工作日
5 質(zhì)控
蛋白濃度、純度等檢查,并提供QC報告 詳細的質(zhì)控報告
為每個(gè)項目提供產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)及完善的質(zhì)控報告
3-5工作日
總時(shí)間 25-40工作日

特色表達體系

● pPic9k-JT質(zhì)粒+GS115菌株高效表達

載體特色

  • 攜帶有AOX1強啟動(dòng)子,含有alpha分泌因子可高效分泌表達;
  • 無(wú)縫克隆連接不懼任何內切酶位點(diǎn);
  • 多個(gè)線(xiàn)性化位點(diǎn):SalⅠ,SacⅠ,BglⅡ;
  • 原核階段可進(jìn)行Amp和Kan雙抗性篩選陽(yáng)性菌株;
  • 真核階段可進(jìn)行His+和G418篩選高表達菌株;
  • 改造過(guò)的多克隆位點(diǎn),克隆不受目的基因中潛在的核酸內切酶位點(diǎn)限制;
  • 載體自帶his 標簽,方便克隆與純化。

● pPic9k-SUMOSTAR質(zhì)粒+GS115菌株高效表達

載體特色

  • 攜帶有AOX1強啟動(dòng)子,含有alpha分泌因子可高效分泌表達;
  • 含有SUMOSTAR融合蛋白,具有很強促表達能力;
  • 無(wú)縫克隆連接不懼任何內切酶位點(diǎn);
  • 含有EK酶切位點(diǎn),酶切可得到無(wú)標簽蛋白;
  • 多個(gè)線(xiàn)性化位點(diǎn):SalⅠ,SacⅠ;
  • 原核階段可進(jìn)行Amp和Kan雙抗性篩選陽(yáng)性菌株;
  • 真核階段可進(jìn)行His+和G418篩選高表達菌株;
  • 改造過(guò)的多克隆位點(diǎn),克隆不受目的基因中潛在的核酸內切酶位點(diǎn)限制;
  • 載體自帶his 標簽,方便克隆與純化。

案例展示

案例1: 酵母表達系統表達高純度蛋白

難點(diǎn):酵母胞內表達,破菌后純化,可以看出裂解液中雜蛋白非常多(泳道1),目的蛋白非常不明顯,經(jīng)過(guò)酵母系統特有的層析系統一次純化,用SDS-PAGE檢測看不到雜帶,純度達到95%以上(泳道6-7)。

泳道1:裂解液
泳道2:上樣穿透液
泳道3:Marker
泳道4-7:不同梯度洗脫下來(lái)的目的蛋白

泳道1:裂解液
泳道2:上樣穿透液
泳道3:Marker
泳道4-7:不同梯度洗脫下來(lái)的目的蛋白

特點(diǎn):酵母分泌表達,蛋白表達后直接分泌到培養基中,基本無(wú)雜蛋白,本身純度就高達90%以上,通過(guò)純化主要是去除色素及培養基中其他殘留物質(zhì),只留下在適宜緩沖中的目的蛋白。

泳道1:發(fā)酵液上清
泳道2:Marker
泳道3:上樣穿透液
泳道4:洗脫下來(lái)的目的蛋白


案例2: 酵母表達系統表達大分子量蛋白

難點(diǎn):700氨基酸以上,81kDa,為了得到較高純度,選擇分泌載體進(jìn)行表達,成功表達并分泌出來(lái)。

N-terminal GST-tagged

泳道1:發(fā)酵液上清
泳道2:上樣穿透液
泳道3:洗脫下來(lái)的目的蛋白
泳道4:Marker


案例3: 酵母表達系統表達小分子蛋白

難點(diǎn):46氨基酸,7kDa,分子量非常小,相對來(lái)說(shuō)不太容易檢測及濃縮,從SDS-PAGE檢測圖來(lái)看表達、純化、收集都非常成功。

泳道1:發(fā)酵液上清
泳道2:洗脫下來(lái)的目的蛋白
泳道3:Marker

難點(diǎn):36氨基酸以上,4kDa,分子量非常小,而且這個(gè)客戶(hù)要求切除標簽,在分子量本身就很小的情況下切除標簽是非常有難度的,但我們經(jīng)過(guò)一系列處理后成功將標簽切除,且WB用標簽抗體檢測目的蛋白中不含蛋白標簽,最終得到了高純度、小分子量的無(wú)標簽蛋白。


案例4:酵母表達系統表達N-型糖基化修飾蛋白

特點(diǎn):接近天然蛋白的修飾,尤其是糖基化修飾在酵母表達系統特別明顯,用SDS-PAGE檢測呈彌散狀條帶且偏大,經(jīng)過(guò)去N-型糖基化修飾的Endo H酶消化,帶型變實(shí)且大小與理論值吻合。

泳道1:純化后的目的蛋白(N-型糖基化修飾)
泳道2:經(jīng)Endo H去糖基化修飾后的蛋白
泳道3:Marker

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