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ELISA試劑盒操作流程及技術(shù)要點(diǎn)

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是指將可溶性的抗原或抗體結合到固相載體上,利用抗原抗體結合專(zhuān)一性進(jìn)行免疫反應的定性和定量檢測方法。

本講以雙抗體夾心法為例,詳細闡述ELISA的操作流程及技術(shù)要點(diǎn),希望對科研朋友的實(shí)驗有所幫助。

雙抗體夾心法

 

1. 試劑配制

1.1 標準品

① 從試劑盒中取出一支標準品,于6000-10000rpm離心30秒。用1mL樣本稀釋液溶解,并用槍頭對準凍存管底部反復吸打5次以助溶解,充分混勻得到標準品S7,放置備用。

② 取7個(gè)1.5mL 離心管(S0-S6)依次排列,各加入250µL樣本稀釋液。吸取250µL 標準品S7到第一個(gè)離心管中(S6),輕輕吹打混勻。從S6中吸取250µL到第二個(gè)EP管中(S5),輕輕吹打混勻。以此類(lèi)推進(jìn)行標準品的倍比稀釋。S0為樣本稀釋液。

編號 S7 S6 S5 S4 S3 S2 S1 S0
pg/mL 2000 1000 500 250 125 62.5 31.25 0

1.2 洗液工作液

濃洗滌液按1:25倍用去離子水進(jìn)行稀釋。例如用量筒量取240mL去離子水,倒入燒杯或其他潔凈容器中,再量取10mL濃洗滌液,均勻加入,攪拌混勻,在臨用前配妥。濃洗滌液低溫保存會(huì )有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。


1.3 生物素標記抗體工作液

生物素標記抗體液按1:100倍用生物素標記抗體稀釋液進(jìn)行稀釋。如10μL生物素標記抗體加990μL生物素標記抗體稀釋液,輕輕混勻,在臨用前10分鐘內配妥。


1.4 辣根過(guò)氧化物酶標記親和素工作液

辣根過(guò)氧化物酶標記親和素按1:100倍用辣根過(guò)氧化物酶標記親和素稀釋液進(jìn)行稀釋。如10μL辣根過(guò)氧化物酶標記親和素加990μL辣根過(guò)氧化物酶標記親和素稀釋液,輕輕混勻,在臨用前10分鐘內配妥。


 

2. 重要提示

2.1 實(shí)驗開(kāi)始前,請提前配置好所有試劑。試劑或樣本稀釋時(shí),均需混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。

2.2 用戶(hù)在初次使用試劑盒時(shí),應將各種試劑管離心數分鐘,以便管蓋和管壁上的液體集中到管底。

2.3 在配制標準品、檢測溶液工作液時(shí),請以相應的稀釋液配制,不能混淆。

2.4 span class="text-yellow">因實(shí)際裝量多于標示裝量,配制工作試劑請用精準的計量工具(移液槍或量筒等)量取,切勿不經(jīng)量取直接使用。

2.5 標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標記親和素工作液稀釋前根據預先計算好的每次實(shí)驗所需的總量配制,實(shí)際配制時(shí)應多配制0.1-0.4mL。請勿重復使用已稀釋過(guò)的標準品、生物素標記抗體工作液、或辣根過(guò)氧化物酶標記親和素工作液。

2.6 標準品的稀釋請勿于板中進(jìn)行,標準品應于臨用前15分鐘內配制。為保證實(shí)驗有效性,建議每次實(shí)驗使用新的標準品。若保存得當,溶解后的標準品S7可在2-8℃保存,7天內使用有效。


 

3. 操作步驟

3.1 將各種試劑移至室溫(18-25℃)平衡至少30分鐘,按前述方法配制試劑,備用。

3.2 加樣:分別設標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加標準品或待測樣本100μL,輕輕晃動(dòng)混勻,覆上板貼,37℃溫育2小時(shí)

3.3 棄去液體,甩干,不用洗滌。

3.4 每孔加生物素標記抗體工作液100μL,覆上新的板貼,37℃溫育1小時(shí)。

3.5 棄去孔內液體,甩干,洗板3次。每次浸泡2分鐘,200μL/每孔,甩干。

3.6 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標記親和素工作液100μL,覆上新的板貼,37℃溫育1小時(shí)。

3.7 棄去孔內液體,甩干,洗板5次。每次浸泡2分鐘,200μL/每孔,甩干。

3.8 依序每孔加底物溶液90μL,37℃避光顯色15-30分鐘。

3.9 依序每孔加終止溶液50μL,終止反應。

3.10 在反應終止后5分鐘內用酶標儀在450nm波長(cháng)依序測量各孔的光密度(OD值)。


 

4. 操作要點(diǎn)

4.1 為保證檢測結果的準確性,建議標準品及樣本均設雙孔測定。每次檢測均需做標準曲線(xiàn)。

4.2 如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高,請先用樣本稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)允箻颖痉显噭┖械臋z測范圍,最后計算時(shí)再乘以相應的稀釋倍數。

4.3 加樣:加樣時(shí),請使用一次性的潔凈吸頭,避免交叉污染。加樣時(shí)應盡量輕緩,避免起泡,將樣本加于酶標板孔底部,切勿沿孔壁加樣。一次加樣時(shí)間最好控制在10分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。

4.4 溫育:為防止樣本蒸發(fā)或污染,溫育過(guò)程中酶標板必須覆上板貼,實(shí)驗過(guò)程中酶標板應避免處于干燥的狀態(tài)。溫育過(guò)程中應隨時(shí)觀(guān)察溫箱溫度是否恒定于37℃,及時(shí)調整。溫育過(guò)程中,溫箱不易開(kāi)啟太多次,以免影響溫度平衡。

4.5 洗滌:洗滌過(guò)程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。

手工洗板方法:吸去(不可觸及孔壁和孔底)或甩掉酶標板內的液體;在實(shí)驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液按200μL/孔注入孔內,浸泡2分鐘。根據操作步驟中所述,重復此過(guò)程數次。

自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機,應在熟練使用后再用到正式實(shí)驗過(guò)程中。

4.6 顯色:為保證實(shí)驗結果的準確性,底物反應時(shí)間到后應盡快加入終止液??稍诩尤氲孜锶芤汉竺扛粢欢螘r(shí)間觀(guān)察一下顯色情況以控制反應時(shí)間(比如每隔10分鐘)。當肉眼可見(jiàn)標準品前3-4孔有明顯梯度藍色,后3-4孔顯色不明顯時(shí),即可加入終止液終止反應,此時(shí)藍色立刻變?yōu)辄S色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。

4.7 底物溶液應為淺藍色或無(wú)色,如果顏色嚴重變深則必須棄用。底物溶液易受污染,請避光妥善保存。