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ELISA常見(jiàn)問(wèn)題及解答

Q: 什么是ELISA?ELISA的常見(jiàn)步驟是什么?

ELISA是酶聯(lián)免疫吸附試驗的縮寫(xiě),用于檢測特定蛋白質(zhì)的存在并確定其濃度。ELISA包括三種類(lèi)型:“夾心法”(sandwich ELISA)、競爭法(competitive ELISA)和間接法(indirect ELISA)。常見(jiàn)的步驟包括儲存、試劑準備、ELISA板處理、樣本或試劑加入、孵育、洗滌和讀取。請參考我們的說(shuō)明書(shū)以獲取詳細信息。

點(diǎn)擊這里查看ELISA試劑盒技術(shù)原理及方法對比

Q: CUSABIO的ELISA試劑盒適用于哪種物種?能否在說(shuō)明書(shū)未提及的物種中使用你們的ELISA試劑盒?

不同的ELISA試劑盒適用于不同的物種,包括人類(lèi)、大鼠、馬、兔、小鼠、綿羊、豬、牛、狗、雞、魚(yú)、猴子、植物等。請參考每個(gè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)以了解適用的物種。對于不同的物種,抗體的特異性和基質(zhì)干擾也會(huì )有所不同。如果您在尋找適用于您所需物種的試劑盒方面遇到困難,可點(diǎn)擊右側在線(xiàn)聯(lián)系客服,我們可以為您推薦合適的試劑盒。

Q: CUSABIO的ELISA試劑盒進(jìn)行了哪些質(zhì)量控制和性能評估?

CUSABIO的ELISA試劑盒都在嚴格的質(zhì)控標準下對下述指標進(jìn)行了仔細評估,包括:線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性、檢測下限、精密度、回收率、穩定性、特異性和天然樣品檢測等,以確保良好的性能。點(diǎn)擊此處了解更多關(guān)于質(zhì)量控制的信息。

Q: CUSABIO的ELISA試劑盒中是否包含標準品或對照品?

我們在定性ELISA試劑盒中提供陽(yáng)性和陰性對照品,而在定量ELISA試劑盒中,我們提供可以作為質(zhì)量控制的標準品。試劑盒的標準品和整個(gè)試劑體系是相匹配的。通過(guò)實(shí)驗,客戶(hù)可以繪制出良好的標準曲線(xiàn),證明包括標準品在內的整個(gè)系統運行良好,因此標準品可以發(fā)揮質(zhì)量控制的作用。建議對標準品進(jìn)行復孔。

點(diǎn)擊此處查看標準曲線(xiàn)繪制方法。

Q: 每次測試中需要做多少次ELISA標準品和樣本?

建議每個(gè)標準品和樣本都做復孔。

Q: 可以混合使用兩種不同ELISA試劑盒的試劑嗎?是否能只購買(mǎi)試劑盒中的標準品/抗體?

不可以,不同批次號的ELISA試劑盒中的試劑不能混合使用,而且我們不單獨銷(xiāo)售試劑盒中的組分。希望您能理解。

Q: CUSABIO的試劑盒中是否添加了BSA和防腐劑?你們的終止溶液是什么?

ELISA試劑盒中的某些組分含有BSA。我們在大多數ELISA試劑盒中使用商業(yè)Proclin 300作為防腐劑,2N硫酸作為終止溶液。

Q: 可以在室溫下進(jìn)行孵育嗎?

除了食品安全和藥物殘留ELISA試劑盒外,所有ELISA試劑盒的孵育溫度均為37℃,因為這是抗原和抗體結合的最佳溫度。我們不建議在室溫下進(jìn)行孵育,因為室溫不穩定。

Q: TMB是什么?為什么在使用TMB系統測試樣本時(shí)應該使用雙光譜?

TMB(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)是ELISA中使用的顯色底物。TMB可以作為氫供體,通過(guò)過(guò)氧化酶(如辣根過(guò)氧化酶)催化過(guò)氧化氫的還原反應,將其轉化為水。加入終止溶液后,反應停止,孔中發(fā)展的顏色從藍色變?yōu)辄S色。吸光度值應該在450 nm波長(cháng)下測量。我們建議使用雙光譜測試樣本,以避免底部的干擾和劃痕導致的誤差。

Q: 當加入終止溶液后,為什么整個(gè)板孔中會(huì )出現黃色或淺黃色?

可能存在的原因有:

a. 添加的試劑不正確。您應該檢查試劑的成分和批號,確保使用的是試劑盒中正確的試劑。

b. 洗板不充分。您應該確保在每個(gè)洗滌步驟中,所有孔中的緩沖液體積相同。在最后一次洗滌后,用紙巾強力吸干板上的殘留緩沖液。

c. 移液管頭或顯色試劑容器受到酶偶聯(lián)物的污染,或空白孔受到陽(yáng)性對照物的污染。您應該在試劑之間更換移液管頭,并為每個(gè)試劑使用單獨的儲液池。操作過(guò)程中使用移液器。

d. 底物暴露在光線(xiàn)下或在使用前受到污染。在準備投入孔中之前,應將底物放置在黑暗中保存。

e. 檢測抗體或親和素-HRP的濃度過(guò)高。您應該檢查計算或進(jìn)一步稀釋后再次嘗試。

f. 孵育時(shí)間或顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)。您應嚴格按照試劑盒的方案進(jìn)行操作。

g. 在讀取時(shí)使用了錯誤的波長(cháng)。波長(cháng)應為450nm,對于TMB還應進(jìn)行650nm波長(cháng)校正。

Q: 當顯色完成后,為什么整個(gè)板孔中包括陽(yáng)性對照的孔中沒(méi)有發(fā)展出任何顏色?

可能存在的原因有:

a. 使用了錯誤的試劑。在準備或使用時(shí),請仔細檢查標簽。

b. 在洗滌或樣品加入步驟中,由于酶偶聯(lián)物的污染,導致顯色試劑失活。您應確保酶偶聯(lián)物容器中沒(méi)有酶抑制劑。檢查并確保洗滌緩沖液容器干凈。

c. 錯誤地使用了某個(gè)試劑或步驟。您應仔細閱讀試劑盒的方案,并嚴格遵循每個(gè)步驟。

Q: 為什么標準品和樣本的孔中出現了弱顏色?

可能存在的原因有:

a. 試劑過(guò)期或儲存不當。您應按照試劑盒的方案進(jìn)行良好的儲存,并在過(guò)期日期之前使用。避免污染。

b. 使用前,試劑和樣本未達到室溫。您應將所有試劑和樣本放置在室溫下30分鐘。

c. 移液吸液不足,吐液速度過(guò)快,吸液管壁上液體過(guò)多或吸液管壁不潔凈。您應使用校準過(guò)的移液器,確保移液管頭與其完全匹配,并緩慢移液。建議一次性使用。

d. 孵育時(shí)間不足。您應準確設置計時(shí)器。

e. 顯色時(shí)間不足。您應在15—30分鐘內進(jìn)行顯色。通常情況下,20分鐘是最佳時(shí)間,除非另有指示。

f. 顯色試劑添加順序錯誤。您應嚴格按照試劑盒的方案進(jìn)行操作。

g. 過(guò)多的洗滌或濃縮洗滌緩沖液稀釋不當。您應減少洗滌的沖擊力:稀釋濃縮洗滌緩沖液,控制洗滌時(shí)間,并根據手冊記錄洗滌次數和劑量。

h. 水質(zhì)不合格。當準備洗滌緩沖液完成后,請檢查并確保其pH為中性。

i. 在洗滌或樣品加入步驟中,由于酶偶聯(lián)物的污染,導致顯色試劑失活。您應確保酶偶聯(lián)物容器中沒(méi)有酶抑制劑。檢查并確保洗滌緩沖液容器干凈。確保純凈水沒(méi)有污染。

Q: 為什么標準曲線(xiàn)看起來(lái)正常,但是樣本的孔中出現了弱顏色?

可能存在的原因有:

a. 樣本中的NaN3防腐劑抑制了酶的反應。您應避免在樣本中使用此防腐劑。

b. 在檢測的樣本中沒(méi)有強陽(yáng)性樣本,結果是正常的。如果您有任何疑問(wèn),應重復試驗。

Q: 為什么以肉眼看結果正常但讀數較低?

在讀數時(shí)使用了錯誤的濾光片。波長(cháng)應為450nm,并使用650nm波長(cháng)校正TMB。

Q: 為什么重復性差?

可能存在的原因有:

a. 試劑盒儲存不當或儲存環(huán)境差。您應按照數據表上的建議儲存所有組分,而不是在室溫下過(guò)長(cháng)時(shí)間。

b. 標準的制備不正確。您應根據試劑盒的方案,使用推薦的稀釋劑嚴格重構標準。在使用前的10分鐘內準備好試劑,并迅速加入孔中。

c. 添加樣本后混勻不充分。當同時(shí)添加多個(gè)試劑時(shí),您應在渦旋混合器中充分混合試劑。在持有試劑時(shí)要小心,避免濺出。

d. 孔讀數重復性差。您應校準酶標儀。

e. 孵育時(shí)間、洗滌條件、顯色條件和操作者不一致。您應重復標準的實(shí)驗。確保反應條件和操作者一致。

f. 洗滌不當。您應使用移液管加入200μL的洗滌緩沖液,或者用移液管充分填滿(mǎn)每個(gè)孔,但不允許溢出。檢查酶標板洗滌器的所有孔口,確保充分的洗滌。

g. 溫度不均勻。您應在孵育期間保持恒定溫度,避免溫度波動(dòng)。

h. 加樣本時(shí)壁面殘留過(guò)多或移液管尖端劃傷孔底。您應緩慢、小心地將移液管尖端沿孔壁降低,避免觸碰孔底。

i. 重復使用材料。您應在樣本之間更換移液管尖端,在試劑之間更換儲液器。

j. 偶爾在截斷值附近出現的陽(yáng)性和陰性值。您應對同一樣本設置3個(gè)重復測量,并在2個(gè)樣本中獲得相同的結果。

k. 加樣本時(shí)的交叉污染。您應在添加樣本時(shí)避免交叉污染。

Q:為什么出現異常顏色?

可能存在的原因有:

a. 手動(dòng)洗滌時(shí)發(fā)生交叉污染。您應在手動(dòng)洗滌時(shí),在填充洗滌緩沖液3次后立即將孔中液體清除,并在下一次設定浸泡時(shí)間以減少交叉污染。

b. 敲擊酶標板時(shí)發(fā)生交叉污染。您應在敲擊酶標板時(shí)使用適當的紙巾。不要將無(wú)關(guān)材料帶入酶標板中。不要在同一位置敲擊以避免交叉污染。

c. 樣本長(cháng)時(shí)間儲存導致污染。您應保持樣本新鮮,或在低溫下儲存以避免污染。

d. 由于孔洗滌器堵塞而導致填充不足或殘留過(guò)多引起的異常發(fā)展顏色。您應使用移液管充分填滿(mǎn)每個(gè)孔,但不允許溢出。檢查酶標板洗滌器的所有孔口,確保充分的洗滌。

e. 樣本離心不完全導致凝固物或沉淀物的凝結或干擾。您應完成血清和血漿的離心。

f. 洗滌緩沖液的準備錯誤或濃縮洗滌緩沖液的錯誤使用。您應按照手冊的要求準備洗滌緩沖液。

Q: 孔板是否預涂層?如果無(wú)法一次性使用完剩余的孔或孔板,應該如何儲存?

是的,酶標板是預包被的。建議將需要進(jìn)行試驗的孔單獨拆出,并將其余的部分在2-8℃的暗處存儲,避免細菌污染。

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