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單抗制備技術(shù)對比

單克隆抗體(Monoclonal antibodies,mAb)是由B細胞產(chǎn)生,并能特異性靶向抗原的免疫球蛋白。單克隆抗體不僅是生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫學(xué)研究中必不可少的工具,其在臨床治療上的應用也以革命性的速度改進(jìn)了多種疑難雜癥的治療方法。

1975年Köhler和Milstein提出的雜交瘤技術(shù)(Hybridoma technology),使得大量獲得單克隆抗體成為可能,為基礎研究及其臨床應用提供了無(wú)限潛力。其他科學(xué)和技術(shù)進(jìn)步也促進(jìn)了單克隆抗體的發(fā)展、豐富了單克隆抗體的制備方法。

經(jīng)過(guò)近50年的發(fā)展,單克隆抗體制備方法不再局限于免疫小鼠的淋巴細胞術(shù),噬菌體展示技術(shù)(Phage display)、人源抗體轉基因小鼠(Human antibody-producing mice)和單B細胞抗體技術(shù)(Single B cell antibody technology)也都陸續登上舞臺。這些方法雖然有各自的局限性,但都已廣泛應用于單克隆抗體篩選。同時(shí),這些技術(shù)都不完全是獨立存在的,如果能充分利用各技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),采用靈活的方法將各技術(shù)優(yōu)化組合就能更加高效、快速地進(jìn)行抗體開(kāi)發(fā)。


1. 雜交瘤技術(shù)

雜交瘤技術(shù)是一種將B細胞與骨髓瘤細胞融合生產(chǎn)小鼠單克隆抗體的傳統方法,是目前應用最廣泛的單克隆生產(chǎn)技術(shù)。在這種技術(shù)中,首先收集免疫小鼠的B淋巴細胞,并將其與BALB/c小鼠骨髓瘤細胞融合,從而形成永生化的雜交瘤細胞。然后篩選雜交瘤細胞,鑒定出能生產(chǎn)特異性抗體的單克隆細胞株。十幾年后,1988年,兔單克隆抗體制備方法首次被《Science》雜志報道 [1]。該研究使用小鼠-兔異種雜交瘤方法生產(chǎn)兔單克隆抗體,但鼠-兔異種雜交瘤細胞分泌抗體的效率較低、不穩定,且無(wú)法長(cháng)時(shí)間分泌抗體。時(shí)間進(jìn)展到90年代中期,1995年,《PNAS》報道了能穩定生產(chǎn)兔單抗的兔-兔雜交瘤細胞 [2]。但兔雜交瘤細胞也被證明不如常規鼠雜交瘤細胞穩定,這大大阻礙了其實(shí)驗室水平的廣泛使用。并且,由于融合和轉化效率低下,使用兔雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體在應用推廣中受到了極大的限制。

經(jīng)過(guò)多年發(fā)展及應用,雜交瘤技術(shù)作為一種成熟的產(chǎn)生鼠單克隆抗體的方法已被廣泛應用于多種抗體的生產(chǎn)。然而,由于缺乏合適的骨髓瘤融合伴侶,雜交瘤技術(shù)一直局限于免疫嚙齒動(dòng)物。20世紀80年代,《PNAS》報道了一種應用人雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)治療用抗體的文章 [3]。利用該方法可以在無(wú)額外修飾的情況下產(chǎn)生天然的人源抗體,并用于臨床治療。隨著(zhù)融合伴侶和電融合技術(shù)的發(fā)展,人雜交瘤細胞融合成功率逐步增加,這將在未來(lái)促進(jìn)治療性抗體的開(kāi)發(fā)。


2. 噬菌體展示技術(shù)

1990年開(kāi)始,噬菌體展示技術(shù)被視為一種新的產(chǎn)生單克隆抗體的方法。這種方法是從淋巴細胞中收獲抗體可變區基因(V gene)全集,克隆VHs和VLs的組合并與外殼蛋白融合后表達于絲狀噬菌體表面,然后篩選表達特異性抗體的噬菌體。與受限于嚙齒動(dòng)物的雜交瘤技術(shù)相比,噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成功用于任何已知免疫球蛋白基因的物種中篩選和分離單克隆抗體 [4,5]。2000年,Rader等人首次介紹了應用噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)兔單克隆抗體的全過(guò)程 [6]。在這篇文章中,Rader等人用噬菌體展示技術(shù)篩選和人源化的人A33兔抗體,不僅對人A33抗原有高特異性,且保留高親和力。目前,噬菌體展示技術(shù)因為其高效、簡(jiǎn)便及體外控制在原核或真核系統中原則參數的能力正逐步成為生產(chǎn)治療用抗體的重要技術(shù)平臺。

隨著(zhù)我們對抗體結構、功能和序列多樣性研究的不斷深入,除了原有的抗體庫外,一種新的合成抗體庫技術(shù)也在不斷發(fā)展。例如,HuCAL&Ylanthia文庫中,為了使篩選出的人源抗體能更好的進(jìn)行分子識別,將精確設計的序列插入抗原結合位點(diǎn),并優(yōu)化設計多種可變重鏈、輕鏈框架區域 [7-10]。隨著(zhù)文庫設計和篩選方法的不斷進(jìn)步,合成抗體文庫將成為快速生產(chǎn)具有高特異性和高親和力單克隆抗體不可或缺的工具。


3. 人源抗體轉基因小鼠

1985年,Alt等人首次提出將人抗體基因引入小鼠種系并使用轉基因小鼠中產(chǎn)生人抗體的想法 [11,12]。隨著(zhù)基因編輯技術(shù)的進(jìn)步,使用人源抗體轉基因小鼠生產(chǎn)人源化抗體已不再是天方夜譚。與其他技術(shù)相比,使用人源抗體轉基因小鼠有許多優(yōu)勢,如無(wú)需人源化、具有更多的生物多樣性,且由于體內成熟具有天然的親和力。但是,人免疫球蛋白體量龐大對轉基因小鼠抗體生產(chǎn)是一個(gè)巨大的挑戰。為了克服這些困難,研究人員們通過(guò)使用不同策略已成功地獲得轉基因動(dòng)物表達的人源抗體庫,如全人源抗體小鼠和嵌合人源抗體小鼠等。


4. 單B細胞抗體技術(shù)

雖然雜交瘤技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)在單克隆抗體生產(chǎn)中廣泛應用,但它們依然存在較難克服的缺點(diǎn)制約著(zhù)抗體生產(chǎn)過(guò)程。近些年,為了克服雜交瘤技術(shù)細胞融合效率低,噬菌體展示技術(shù)導致重鏈、輕鏈的天然同源配對丟失等問(wèn)題,單B細胞抗體技術(shù)正被逐步開(kāi)發(fā)和應用。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),單B細胞抗體技術(shù)包含以下幾個(gè)步驟:

a. 從外周血或免疫器官中初步提取淋巴細胞;

b. 使用磁性活化細胞分選(MACS)或熒光活化細胞分選(FACS)技術(shù)鑒定和分離出特定的B細胞;

c. 將分離出的B細胞進(jìn)行單細胞培養;

d. 使用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和抗體特異性引物鑒定單B細胞分泌抗體的特異性;

e. 擴增特異抗體基因;

f. 將抗體基因克隆到表達載體中,并在細菌或細胞系統中表達;

g. 純化表達產(chǎn)生的抗體,并用ELISA等方法進(jìn)行評估。

單B細胞抗體技術(shù)現在已廣泛用于人和小鼠單克隆抗體生產(chǎn),如一些治療性中和單抗,可用于治療多種疾病,包括癌癥、自身免疫性疾病和傳染性疾病亡 [13,14]。

方法 雜交瘤技術(shù) 人源抗體轉基因小鼠 噬菌體展示技術(shù) 單B細胞抗體技術(shù)
優(yōu)勢
  • 技術(shù)成熟
  • 研發(fā)成本低
  • 可用雜交瘤技術(shù)獲得人源抗體
  • 良好的免疫原性
  • 親和力高
  • 基因來(lái)源靈活
  • 隨機庫可以避免免疫耐受
  • 可以靈活、特異地調整設計方案
  • 可長(cháng)時(shí)間保存
  • 無(wú)需雜交瘤融合
  • 制備周期短
  • 重鏈、輕鏈天然配對
  • 無(wú)需合成基因
  • 可直接獲得各物種抗體
劣勢
  • 周期長(cháng)
  • 融合率低
  • 需要進(jìn)行人源化
  • 存在免疫耐受
  • 依然有鼠抗產(chǎn)生
  • 難以免疫毒性抗原
  • 重鏈輕鏈非天然配對
  • 展示效率具有偏好性
  • 需要再次進(jìn)行功能驗證
  • 需要新鮮樣本
  • 抗原特異性細胞比例低
  • 操作環(huán)境要求嚴格

參考文獻

[1] Raybould TJ, Takahashi M. Production of stable rabbit-mouse hybridomas that secrete rabbit mAb of defined specificity. Science (1988) 240:1788–90. doi:10.1126/science.3289119

[2] Spieker-Polet H, Sethupathi P, Yam PC, Knight KL. Rabbit monoclonal anti-bodies: generating a fusion partner to produce rabbit-rabbit hybridomas. Proc Natl Acad Sci U S A (1995) 92:9348–52. doi:10 073/pnas.92.20.9348

[3] Olsson L, Kaplan HS. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 77:5429–31. doi:10.1073/pnas.77.9.5429

[4] Lowe D, Jermutus L. Combinatorial protein biochemistry for therapeutics and proteomics. Curr Pharm Biotechnol (2004) 5:17–27. doi:10.2174/ 1389201043489585

[5] Peterson NC. Advances in monoclonal antibody technology: genetic engineering of mice, cells, and immunoglobulins. ILAR J (2005) 46:314–9. doi:10.1093/ilar.46.3.314

[6] Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, et al. The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies. J Biol Chem (2000) 275:13668–76. doi:10.1074/jbc.275.18.13668

[7] Knappik A, Ge L, Honegger A, Pack P , Fischer M, Wellnhofer G, et al. Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J Mol Biol (2000) 296:57–86. doi:10.1006/jmbi.1999.3444

[8] Rothe C, Urlinger S, Lohning C, Prassler J, Stark Y , Jager U, et al. The human combinatorial antibody library HuCAL GOLD combines diversification of all six CDRs according to the natural immune system with a novel display method for efficient selection of high-affinity antibodies. J Mol Biol (2008) 376:1182–200. doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018

[9] Tiller T, Schuster I, Deppe D, Siegers K, Strohner R, Herrmann T, et al. A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties. MAbs (2013) 5:445–70. doi:10.4161/mabs.24218

[10] Shim H. Synthetic approach to the generation of antibody diversity. BMB Rep (2015) 48:489–94. doi:10.5483/BMBRep.2015.48.9.120

[11] Alt FW, Keith Blackwell T, Yancopoulos GD. Immunoglobulin genes intransgenic mice. Trends Genet. 1985;1:231–6.

[12] Jakobovits A, Amado RG, Yang X, Roskos L, Schwab G. From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice. Nat Biotechnol. 2007;25:1134–43

[13] Tiller T. Single B cell antibody technologies. N Biotechnol (2011) 28:453–7. doi:10.1016/j.nbt.2011.03.014 41.

[14] Flego M, Ascione A, Cianfriglia M, Vella S. Clinical development of monoclonal antibody-based drugs in HIV and HCV diseases. BMC Med (2013) 11:4. doi:10.1186/1741-7015-11-4